El ensayo es presentado dentro del tema de los modelos animales no convencionales y su apoyo a la investigación científica. Se recrea sobre el uso de la larva del mosquito Aedes aegypti (Aa) que, al igual que otras especies silvestres, como el pez cebra y las lombrices de tierra, se ha convertido en tendencia debido a su eficiencia en la generación de nuevos conocimientos. Dicha larva, más allá de ser vista solo como un blanco a ser eliminado para el control epidemiológico de las enfermedades transmisibles, como el zika, el dengue y la chikungunya, en el ensayo la hemos consideramos como una entidad biológica capaz de proporcionar variables fisiológicas medibles y cuantificables de gran utilidad en el campo de toxicología experimental. Como un aporte al tema de los animales no convencionales y su apoyo a la investigación científica, el ensayo promueve a larva del mosquito Aa dentro de un protocolo innovador denominado Aa-Integral-Tox, inspirado en el protocolo Ze-Global-Tox utilizado para el pez cebra y que combina secuencialmente la respuesta neuro cardiológica en un mismo animal. Una combinación que lo fortalece como un protocolo ejemplificante del, “cómo hacer más con menos”, ya que cumple el principio de las 3R, Reemplazo, Reducción y Refinamiento, sustituyendo los altos costos de los animales convencionales, respetando las normas bioéticas, permitiendo un mayor registro de variables fisiológicas con un menor número de individuos e incluso promoviendo el mejor uso de los propios recursos del medio ambiente en tiempos de crisis.
El ensayo es presentado dentro del tema de los modelos animales no convencionales (Younes y col, 2021), y su apoyo a la investigación científica. Se recrea, en el uso de la larva del mosquito Aedes aegypti (Aa) como un modelo alternativo para la experimentación, ya que, al igual que otras especies silvestres, como el pez cebra y las lombrices de tierra (Šrut M, 2022), se ha convertido en tendencia, debido a su eficiencia en la generación de nuevos conocimientos, solventando situaciones impredecibles y no resueltas con los modelos animales convencionales.
El ensayo gira alrededor de la siguiente pregunta, ¿por qué no pensar en las larvas del mosquito Aa, como un posible modelo in vivo de invertebrado no convencional para la investigación científica, más allá de ser considerado como el blanco por excelencia a ser eliminado en un control epidemiológico?
Si bien es cierto que la eliminación de la larva del mosquito Aa es considerada como una estrategia efectiva para el control epidemiológico de las desbastadoras enfermedades transmisibles, como el zika, el dengue y la chikungunya (Weaver y col, 2018), también es cierto que las larvas, al ser consideradas como una entidad biológica, son portadoras de características fisiológicas hasta el momento poco explotadas. Entre ellas, las actividades neuro y cardiológicas, con las cuales el modelo larvario estaría contribuyendo in vivo, a la obtención de nuevos conocimientos en muchos campos de la investigación científica; entre ellos en el campo de la toxicología experimental.
Como entidad biológica, cuenta con un sistema nervioso y un sistema cardiaco, entre otros sistemas que, ante estímulos de distintas naturalezas, se expresan con respuestas fácilmente observables, medibles y cuantificables; las cuales son desestimadas cuando se concibe a la larva, solamente como un blanco a ser eliminado. Se pierde asi, la posibilidad de desarrollar metodologías integradoras para la detección de toxicidad en órganos in vivo, asi como también se pierde la posibilidad de profundizar sobre las vías de generación de nuevos conocimientos confiables y reproducibles, en el campo de la neuro-cardio-toxicidad.
Es por ello que, dentro del tema de los modelos animales no convencionales y su apoyo a la investigación científica, el presente ensayo promueve el uso de la larva del mosquito Aa como una entidad biológica y un modelo alternativo no convencional in vivo para la experimentación, enmarcado dentro de un protocolo innovador e integrador, denominado Aa-Integral-Tox (Alvarez y col, 2022) (ver figura 1). El mismo, ha estado inspirado en el protocolo Ze-Global-Tox utilizado para el pez cebra (Cornet y col, 2017) y ha sido adaptado para las larvas del mosquito Aa, bajo apropiadas y estrictas condiciones de laboratorio. En el protocolo se integra secuencialmente la respuesta neuro y cardiológica en un mismo animal; respuestas fisiológicas enmascaradas cuando la entidad biológica se destruye como blanco epidemiológico. Dichas respuestas se resaltan a través de evidencias obtenidas en el laboratorio y valoradas con experiencias de otros autores.
Fuente: Alvarez y col, 2022. Rev. Fac. Farmacia. 85: 1-2.
¿Por qué las lavas del mosquito Aedes aegypti?
Cabe destacar que la larva del mosquito Aa, concebida dentro del protocolo integrador, Aa-Integral-Tox, surgió como consecuencia del gran impacto negativo generado por la pandemia, COVID-19, año 2020. La pandemia se tradujo en una pérdida del equilibrio en todos los aspectos de la vida cotidiana, sin escaparse de ello, particularmente, la vida en el campo de la actividad científica. En lo personal, se vivió la perdida de la población de peces cebra, el modelo animal no convencional mantenido en nuestro laboratorio y con el cual veníamos aportando resultados valiosos en el campo de la toxicología experimental (Zanotty y col 2019; Alvarez y col 2021). Los peces cebras Danio rerio, y sus alevines, se nos morían, se nos desaparecían, nuestros acuarios y criaderos quedaban vacíos, debido a la imposibilidad de garantizar su mantenimiento por la ausencia laboral que nos provocó el miedo al contagio con tan nefasto virus.
Sin embargo, el gran impacto negativo despertó, en la mayoría de los científicos, las alertas cognitivas que nos permitieron generar innumerables estrategias para sobrevivir ante tan desbastadora “sorpresa”. Fue una época terrible, en donde la desesperanza se adueñó de toda posibilidad de poder cumplir los compromisos académicos, especialmente cumplir con el desarrollo de las hipótesis planteadas en trabajos ya encaminados con estudiantes de Pre y de Post-grado, teniendo que detener sus expectativas sobre la generación de los nuevos conocimientos para la culminación de sus estudios.
Fue entones, bajo la presión de la crisis y con las alertas cognitivas encendidas, parado frente al jardín del balcón de mi residencia, con la mirada gacha y apesadumbrada, observe, en un matero de arcilla, el movimiento serpenteante de numerosos organismos acuáticos que me hicieron recordar la actividad motora (AM), de la población larvaria del pez cebra. Fue un momento de luces que me permitió decir “bingo” ¡hay aquí una alternativa! Era una población larvaria del mosquito Aa, el importante vector transmisor de las numerosas enfermedades infecciosas que han perturbado el equilibrio de vida humana; tales como el zika, el dengue y la chikungunya, entre otras (Macêdo y col, 2021). Se encontraban en plena actividad, alojadas en ese reservorio natural de aguas cristalinas estancadas, mostrando su AM y conducta de nado, entre otras funciones como la actividad cardiaca contractil (ACC), que más tarde fui descubriendo.
Apareció asi, en nuestro laboratorio, un nuevo modelo alternativo no convencional como las larvas del mosquito Aa, permitiendo recobrar el equilibrio en nuestra actividad y sobreviviendo a los tiempos de crisis. Desde ese momento mágico, la entidad biológica me vislumbro como un posible modelo in vivo de invertebrado con el cual se podía retomar el equilibrio de nuestra actividad en pro de la toxicología experimental y permitir asi sobrevivir al desastre de la pandemia.
Había entonces que fortalecer ese modelo, creando una metodología integradora para la detección de toxicidad en órganos in vivo e ir logrando su certificación como un modelo eficiente para ensayos bio-toxicológicos. Para ello, se hacía indispensable comenzar a estudiar y profundizar sobre esas características fisiológicas de las larvas que, en condiciones normales y de experimentación, nos permitieran obtener nuevos conocimientos sobre la propia fisiología larvaria asi como de los posibles sistemas u órganos blancos a ser considerados y estudiados.
Comenzó entonces la revisión bibliográfica para el presente ensayo, circunscrita a la información que nos orientaba a obtener luces respeto al uso de las larvas del mosquito Aa como un posible modelo no convencional para la experimentación en toxicología. Hasta el momento en que se realizó la búsqueda bibliográfica, se destacaban, en su mayoría, los trabajos epidemiológicos concernientes al control de las enfermedades transmisibles, asi como abundantes ensayos sobre propiedades larvicidas de numerosas nuevas moléculas (Buscador Pubmed. Años 2000-2023. Palabras claves: larvicidal chemicals against aedes aegypti. Ultima revisión.12/05/2023.4:55 pm); una estrategia no negada por su eficiencia en la profilaxis de dichas enfermedades transmitidas por este vector (Chala y Hamde, 2021).
Casi inexistente o muy escasa información destacaba la participación de la larva de Aa como modelo no convencional para la investigación. Surgía acá lo interesante; la mayoría de los reportes destacan los índices de letalidad larvaria, el porcentaje de mortalidad larvaria, despreciando el análisis de las señales fisiológicas subyacentes a la respuesta letal, que era sobre la cual la mayoría de los autores hacia énfasis. Quedaba entones la respuesta subletal neuro-cardiológica solapada y subestimada, por lo cual, en nuestro empeño de promover a la larva del mosquito Aa como un modelo animal no convencional eficiente para muchos campos de la investigación científica, se comenzaría entonces a visibilizarla incorporadas en el protocolo Aa-Integral-Tox.
¿Por qué promover a la larva del Aa como modelo no convencional para la investigación?
Por una parte, como entidad biológica, la larva del Aa, expresa un movimiento serpenteante cuya lectura pone en evidencia la presencia de una activa función del sistema nervioso. Un sistema nervioso caracterizado por cadenas ganglionares (Vásquez y De Abrego 2017), ubicadas a lo largo del cuerpo, con percepciones para todos los sentidos y que permite profundizar sobre la AM de la población larvaria; una evidente respuesta neurológica de gran utilidad. Por otra parte, también como entidad biológica, posee una estructura cardiaca de forma tubular que se extiende desde la porción torácica, pasando por la región abdominal y terminando en la región caudal. La misma, al igual que en la mayoría de los animales de experimentación, expresa ciclos rítmicos de contracción y relajación cuya funcionalidad está regida por las uniones reversibles entre Ca+2 y las proteínas contráctiles como paso final de la actividad cardiaca contráctil (Glen y col., 2010). Ambas características han sido aprovechadas en la metodología integradora del protocolo in vivo Aa-Integral-Tox.
Respecto a la función neurológica, valorada a través del perfil de la actividad motora (AM), se registra como una secuencia de movimientos zigzagueantes, medibles y cuantificables (ver figura 2). Acá, se resalta como una señal de la actividad del sistema nervioso y de gran valor en las investigaciones de nuevos fármacos, neurotóxicos o neuro protectores. Asi mismo, una señal altamente recomendable para los estudios sobre fisiología larvaria, particularmente los vinculados con las investigaciones en el campo de las respuestas neuromotoras y de los sistemas sensoriales de los mosquitos. También se destaca como un recurso valioso debido a la amplia variedad de vías bio-sensoriales presentes a toda la estructura larvaria y que han sido descrita por otros autores (Montell y Zwiebel, 2016). Muchas de esas vías están mediadas por receptores y particularmente por células fotorreceptoras especializadas (Hu y col., 2014). Con nuestras investigaciones y registros de la AM (ver figura 2), hemos destacando la sensibilidad larvaria a la luz ultravioleta (Alvarez y col, 2021, 2022, 2023); una digna señal de sensibilidad neuronal a ser considerada entre una de las tantas razones para promover la larva del Aa, como un modelo in vivo no convencional de apoyo a la investigación científica.
Figura 2. Perfil de movimiento larvario in vivo. (a), graficación de la actividad motora (a’). Fuente original. Laboratorio de Microscopia. Instituto Anatómico. Facultad de Medicina UCV. Alvarez y col. 2022. Análisis en programa Video Tracker y programa estadístico Graph Pad Prims
Respecto a la función cardiaca, el perfil de actividad cardiaca contractil (ACC), se presenta como una secuencia de picos de contracción-relajación que recuerdan las espigas de un registro de electrocardiograma del humano (ver figura 3). Sin embargo, acá son picos de contracción y no de actividad eléctrica, solo que por su similitud con las espigas del electrocardiograma hemos usado tal comparación de un subterfugio didáctico. Son, por tanto, picos de contractilidad posibles de ser medibles y cuantificables y que representan una extraordinaria señal de la funcionalidad contractil para el protocolo Aa-Integral-Tox, con el cual se aprovecha para profundizar investigaciones en el campo de la cardiología experimental, paralelamente a la determinación de expresiones de cardiotoxicidad. Con nuestras investigaciones y registros de ACC, se ha podido indagar sobre la bioactividad de numerosos compuestos farmacológicos, entre ellos un fármaco como el carvativir, recientemente promovido para el tratamiento de COVID-19. Asi, la experiencia piloto, con resultados aun no concluidos y no publicados, se ha podido describir que, en el tratamiento agudo con el fármaco, las larvas de Aa, luego de 72 horas de incubación, mantienen su viabilidad, sin cambios aparentes de su ACC (ver figura 4).
Figura 3. El Triángulo de Einthoven en la porción caudal del cuerpo larvario simulando las derivaciones frontales del electrocardiograma (DI, DII, DII, en el humano. En el caso larvario un registro de la ACC en la derivación III.
Figura 4. Registro grafico de la ACC registradas en el área triangulada de la porción caudal larvaria. DI, DII, DIII. Larvas tratadas 72 horas con carvativir. Ondas de contractilidad.
Cabe destacar que amabas señales larvarias como la actividad motora (AM) y la actividad cardiaca contractil (ACC), representan una extraordinaria razón para promover a este valioso invertebrado como un modelo de experimentación no convencional y de gran apoyo para la investigación científica. Dos fuertes blancos para la acción de agentes xenobioticos, como el caso del agente farmacológico carvativir, entre muchos otros, que permiten profundizar en investigaciones biomédicas como las requeridas en el campo de la sensibilidad neurológica y cardiaca. Ambas señales incorporadas al protocolo, Aa-Integral-Tox, hacen de este una fuerte herramienta para la apropiada dosificación de la concentración de cualquier fármaco (letal cincuenta CL50, toxica cincuenta CT50), en un mismo animal. Una vez permitido esto, ambas señales, se hacen visible, medibles y cuantificables, con el uso de técnicas actualizadas de análisis, particularmente como aquellas que usan otros autores para proporcional la evidencia cuantitativa (Conklin y col, 2015; Vásquez y De Abrego 2017). Nuestro modelo larvario también se ha visto fortalecido al poder expresar datos cuantitativos haciendo uso de similares herramientas; en nuestro caso con el uso de los programas ImageJ y Video Trcker, como ha sido ilustrado. También el uso de programas avanzado de análisis estadístico como el programa GraphPad Prims, ha permitido refinar y fortalecer los datos obtenidos bajo el régimen de nuestro protocolo Aa-Integral-Tox.
III.-CONCLUSIONES
Con los contenidos antes expuestos resulta evidente que, si es posible pensar en la larva del mosquito Aedes aegypti, cómo un modelo in vivo de invertebrado no convencional para la investigación científica, más allá de ser considerado como el blanco por excelencia a ser eliminado en un control epidemiológico. Al ser concebido dentro de un protocolo de experimentación, como el Aa-Integral-Tox, adaptado a estrictas condiciones de laboratorio y apoyado con técnicas actualizada de procesamiento de datos, se garantiza el avance en los bioensayos de toxicidad bajo el marco del principio de las 3R de la investigación animal. Reemplazo, Reducción y Refinamiento, particularmente, sustituyendo el uso de animales convencionales por los no convencionales de menor costo y mayor cumplimiento de las normas bioéticas, registrando mayor cantidad de variables con un menor número de individuos e impulsando los conceptos del mejor uso de los recursos del propio medio ambiente.
Por otra parte, con la ilustración de estas dos importantes señales fisiológicas obtenidas del modelo larvario del Aa, se da respuesta a la pregunta con la que iniciamos el presente ensayo, ya que resulta evidente que la larva del mosquito Aa, como una entidad biológica, ha dejado claro que efectivamente se destaca como un modelo animal no convencional y que puede brindar un contundente apoyo a la investigación científica. Cabe destacar que después de todo no se rompe por completo con el principio epidemiológico de eliminarla para el control biológico, más bien lo fortalece, pero con otra visión. La población larvaria continuara siendo eliminada, pero no por muerte, sino por ser de utilidad debido a sus propiedades fisiológicas. La larva viva es, obviamente, la que nos está brindando esa extraordinaria posibilidad de verla incorporada al espacio científico como un modelo no convencional en donde se integran las órganos-funcionalidades en un mismo animal, valiosas señales fisiológicas, relevantes para las investigaciones sobre las etiologías de patologías neurológicas y cardiacas. De tal manera que, desde mi punto de vista, ha comenzado a cambiar la visión de ver a la larva como un blanco a ser eliminado; desde ahora, están siendo vista como blanco a ser usado como un modelo animal no convencional de gran apoyo para la experimentación científica.
Referencias
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